基因工程

基本概念

基因工程（DNA重组技术）：在体外将目的基因与载体DNA连接→导入受体细胞→表达/扩增
工具酶：
- 限制性核酸内切酶：识别特定DNA序列并切割（Type II最常用）→产生粘性末端/平端。如EcoRI识别GAATTC
- DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶、Taq DNA聚合酶等

基因工程载体

载体	容量	用途
质粒	<10kb	常规克隆、原核表达
λ噬菌体	~20kb	基因组文库
黏粒	~45kb	—
BAC/PAC/YAC	100kb~1Mb	大片段操作

载体必备要素：复制起点(ori)、多克隆位点(MCS)、选择标记(抗性基因如Amp^R、lacZ蓝白斑筛选)

基因工程的一般过程

目的基因获取：PCR扩增、RT-PCR(从mRNA)、化学合成、基因文库筛选
基因重组：目的基因 + 载体 → 连接酶→重组DNA分子
转化/转染：重组DNA导入宿主细胞（原核：感受态转化；真核：脂质体/电穿孔/病毒）
筛选与鉴定：抗生素筛选 + lacZ蓝白斑初筛 + 酶切验证 + 测序
表达与纯化：诱导表达→蛋白纯化（His标签亲和层析等）

克隆基因的表达

原核表达：大肠杆菌最常用→操作简便、产量高，但不能进行翻译后修饰（糖基化等）
真核表达：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞→有修饰功能

基因工程技术在医学方面的应用

重组蛋白药物：胰岛素（首个）、生长激素、EPO、干扰素
基因诊断：PCR/RT-PCR、基因芯片、FISH
基因治疗：正常基因导入缺陷患者细胞（如CAR-T）
转基因动物/植物
法医学：DNA指纹、亲子鉴定